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本制品是一种基于Biotin-NHS对蛋白、抗体或其它含有伯氨基的分子进行生物素快速标记的试剂盒。本试剂盒标记的蛋白、抗体等可以用于免疫组织化学(IHC)、免疫印迹(WB)、ELISA、蛋白检测、流式细胞分析、Southern、Northern等实验。

• 本试剂盒标记效率高、标记速度快、操作简单。本试剂盒提供的Biotin-NHS可高效标记各种带伯胺基的蛋白、抗体或其它分子；提供了配套的不同柱床体积的脱盐柱，可轻松去除过量的标记试剂和盐离子并获得生物素标记的生物大分子，而不需要进行透析或者凝胶过滤。
  
• 本试剂盒标记时间短、体系灵活。本试剂盒可以在2小时内完成整个标记反应，能有效保证了生物大分子的活性。

Biotin-NHS是一种短链、胺反应活性的NHS酯生物素化试剂，全称为琥珀酰亚胺生物素间隔臂即添加至靶标的总长度约为13.5Å，仅由天然生物素戊酸基团组成，能使溶液中的蛋白、抗体或任何含伯胺的其它生物分子实现简单高效的生物素化。Biotin-NHS具有膜通透性，因此可用于细胞内标记。Biotin-NHS是最常用的生物素化试剂之一，可在pH7.0～9.0的缓冲液中与伯氨基(-NH2)发生有效反应，形成稳定的酰胺键。包括抗体在内的蛋白质除了每个肽链的氨基末端，通常还含有多个赖氨酸(K)残基，因此具有多个伯胺作为Biotin-NHS标记的靶标。

• 需自备1×PBS。
  
• 待标记分子的溶液里不能含有除待标记分子上的额外的伯胺基团或胺基离子，推荐使用PBS溶解待标记分子。为提升标记效果，待生物素标记的生物大分子的浓度不能太低。
  
• Biotin-NHS-Sulfo很容易受潮水解失活，保存时一定要注意保持干燥。每次使用时必须平衡至室温，才能打开盖子，以避免受潮。适量称取后配制成母液，可-80℃分装保存至少一周，但最好现配现用。
  
• 对于不同体积和浓度的待标记分子，请选择适当的标记试剂盒。三种脱盐柱柱床体积分别0.5mL、2mL和8mL，对应的脱盐样品体积上限分别约为130μL、0.5mL和2.5mL，蛋白量上限分别约为0.3mg、1.3mg和6.6mg。
  
• 对于分子量小于5kDa的生物大分子，推荐使用YT181.html" target="_blank">样品脱盐柱(>0.7kDa,0.3mL)。

• 准备工作
  
  • 将要标记的生物大分子溶解在1×PBS中，使终浓度约为0.5～3mg/mL。如果溶液里有额外的伯胺(如Tris或Glycine)或者铵离子，推荐使用百奥莱博脱盐柱(YTC0511/YTC0512/YTC0500/YTC0501/YTC0502)进行脱盐处理。
    
  • 5mg/mL Biotin-NHS-Sulfo的配制：称量适量的Biotin-NHS-Sulfo，用冰浴预冷的PBS进行溶解配制成5mg/mL Biotin-NHS-Sulfo。
    
    • 请适量称取，最好现配现用；如有剩余，置于-80℃保存，至少一周有效。
  • 1M NaHCO3的配制：根据样品量配制适量的1M NaHCO3溶液，如称取10mg NaHCO3，加入119μL超纯水即得1M NaHCO3溶液。NaHCO3可维持标记反应体系的pH在7～9之间，提高标记效率，一般加入量为样品体积的1/10。
    
    • NaHCO3溶液需现用现配。
• 小量样品(不超过130μL，蛋白浓度不超过3mg/mL)的生物素标记反应
  以下以样品体积为0.1mL为例，其它样品体积可按比例调整。
  
  • 将需要标记的0.1mL生物大分子转移到洁净的1.5mL离心管，加入10μL新鲜配制的1M NaHCO3溶液。
    
  • 根据样品浓度，参照下表计算加入5mg/mL Biotin-NHS-Sulfo的体积。
    

    生物分子浓度n	生物分子体积	Biotin-NHS-Sulfo体积
    0.5mg/mL	0.1mL	1μL
    1.0mg/mL	0.1mL	2μL
    1.5mg/mL	0.1mL	3μL
    2.0mg/mL	0.1mL	4μL
    2.5mg/mL	0.1mL	5μL
    3.0mg/mL	0.1mL	6μL

  • 在室温(约25℃)反应30～60分钟或者4℃反应2小时，反应过程推荐在翘板摇床(也称侧摆摇床)上进行。
    
  • 脱盐柱的准备：移去脱盐柱脱盐柱(5kDa,0.5mL)的下堵头，置于1.5mL离心管或2mL洗脱管中，1000×g离心1分钟，丢弃脱盐柱离心下来的保存溶液，并重新把脱盐柱放回离心管中。使用非水平转头的情况下，由于离心会使树脂压实形成一个向上的斜面，该斜面的方向宜在后续步骤中保持，所以在脱盐柱外壳上的斜面向上位置做标记，在随后的离心步骤中需要调整好离心管的放入方向，确保离心后斜面的方向和位置不会改变。
    
  • 脱盐柱的预平衡：向脱盐柱树脂顶部加入0.5mL 1×PBS以平衡脱盐柱，1000×g离心1分钟，丢弃溶液，重复本步骤2～3次。
    
  • 上样：将脱盐柱放入新的1.5mL离心管中，把步骤2c的样品(不能超过130μL)加入到树脂的中心位置，使树脂吸入样品。
    
    • 样品体积不要超过脱盐柱规定的样品量体积，否则会降低样品回收率。
  • 洗脱：将脱盐柱1000×g离心2分钟，流穿液含有纯化的生物素标记的生物大分子，可以直接用于后续实验。如需保存，请保存在合适的条件。
    
    • 脱盐柱不适合重复使用。
  • 检测：后续可以使用YTB4112.html" target="_blank">HRP标记链霉亲和素或碱性磷酸酶标记链霉亲和素检测生物素标记的生物大分子的标记效果。
• 中量样品(不超过0.5mL，蛋白浓度不超过3mg/mL)的生物素标记反应
  以下以样品体积为0.5mL为例，其它样品体积可按比例调整。
  
  • 将需要标记的0.5mL生物大分子转移到洁净的1.5mL离心管，加入50μL新鲜配制的1M NaHCO3溶液。
    
  • 根据样品浓度，参照下表计算加入5mg/mL Biotin-NHS-Sulfo的体积。
    

    生物分子浓度n	生物分子体积	Biotin-NHS-Sulfo体积
    0.5mg/mL	0.5mL	5μL
    1.0mg/mL	0.5mL	6μL
    1.5mg/mL	0.5mL	8μL
    2.0mg/mL	0.5mL	11μL
    2.5mg/mL	0.5mL	13μL
    3.0mg/mL	0.5mL	15μL

  • 在室温(约25℃)反应30～60分钟或者4℃反应2小时，反应过程推荐在翘板摇床(也称侧摆摇床)上进行。
    
  • 脱盐柱的准备：移去脱盐柱脱盐柱(5kDa,2mL)的下堵头，置于15mL离心管中，1000×g离心2分钟，丢弃脱盐柱离心下来的保存溶液，并重新把脱盐柱放回离心管中。使用非水平转头的情况下，由于离心会使树脂压实形成一个向上的斜面，该斜面的方向宜在后续步骤中保持，所以在脱盐柱外壳上的斜面向上位置做标记，在随后的离心步骤中需要调整好离心管的放入方向，确保离心后斜面的方向和位置不会改变。
    
  • 脱盐柱的预平衡：向脱盐柱的树脂顶部加入1.5mL 1×PBS以平衡脱盐柱，1000×g离心2分钟，丢弃溶液，重复本步骤2～3次。
    
  • 上样：将脱盐柱放入新的15mL离心管中，把步骤3c的样品(不能超过0.5mL)加入到树脂的中心位置，使树脂吸入样品。
    
    • 如果样品体积<400μL，在树脂吸入样品后再加入100μL超纯水可以增加样品回收率，但同时会稀释标记样品的浓度。
  • 洗脱：将脱盐柱1000×g离心2分钟，流穿液含有纯化的生物素标记的生物大分子，可以直接用于后续的实验。如需保存，请保存在合适的条件。
    
    • 脱盐柱不适合重复使用。
  • 检测：后续可以使用YTB4112.html" target="_blank">HRP标记链霉亲和素或碱性磷酸酶标记链霉亲和素检测生物素标记的生物大分子的标记效果。
• 大量样品(不超过2.5mL，蛋白浓度不超过3mg/mL)的生物素标记反应
  以下以样品体积为2mL为例，其它样品体积可按比例调整。
  
  • 将需要标记的2mL生物大分子转移到洁净的15mL离心管，加入200μL新鲜配制的1M NaHCO3溶液。
    
  • 根据样品浓度，参照下表计算加入5mg/mL Biotin-NHS-Sulfo的体积。
    

    生物分子浓度n	生物分子体积	Biotin-NHS-Sulfo体积
    0.5mg/mL	2mL	20μL
    1.0mg/mL	2mL	24μL
    1.5mg/mL	2mL	32μL
    2.0mg/mL	2mL	44μL
    2.5mg/mL	2mL	52μL
    3.0mg/mL	2mL	60μL

  • 在室温(约25℃)反应30～60分钟或者4℃反应2小时，反应过程推荐在翘板摇床(也称侧摆摇床)上进行。
    
  • 脱盐柱的准备：移去脱盐柱脱盐柱(5kDa,8mL)的下堵头，置于50mL离心管中，1000×g离心2分钟，丢弃脱盐柱离心下来的保存溶液，并重新把脱盐柱放回离心管中。使用非水平转头的情况下，由于离心会使树脂压实形成一个向上的斜面，该斜面的方向宜在后续步骤中保持，所以在脱盐柱外壳上的斜面向上位置做标记，在随后的离心步骤中需要调整好离心管的放入方向，确保离心后斜面的方向和位置不会改变。
    
    • 脱盐柱(5kDa,8mL)放入50mL离心管内进行离心时，需要使用相应的适配器(Adaptor)，如12mL层析柱转50mL离心管适配器。
  • 脱盐柱的预平衡：向脱盐柱的树脂顶部加入5mL 1×PBS以平衡脱盐柱，1000×g离心2分钟，丢弃溶液，重复本步骤2～3次。
    
  • 上样：将脱盐柱放入新的50mL离心管中，把步骤4c的样品(不能超过2.5mL)加入到树脂的中心位置，使树脂吸入样品。
    
    • 如果样品体积<1.8mL，在树脂吸入样品后再加入200μL超纯水可以增加样品回收率，但同时会稀释标记样品的浓度。
  • 洗脱：将脱盐柱1000×g离心2分钟，流穿液含有纯化的生物素标记的生物大分子，可以直接用于后续的实验。如需保存，请保存在合适的条件。
    
    • 脱盐柱不适合重复使用。
  • 检测：后续可以使用YTB4112.html" target="_blank">HRP标记链霉亲和素或碱性磷酸酶标记链霉亲和素检测生物素标记的生物大分子的标记效果。